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四种蛋白含量测定方法比较

发布时间: 2022-06-24  点击次数: 788次

蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要和最必需的组成成分,它是构成人体及所有动物机体组织干物质的主要部分。例如,人体按总量计算,干重54%是蛋白质,即除去水分后,蛋白质约占体重的一半左右,可见蛋白质是生命活动中最重要的物质基础。

       蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子化合物,它水解的最终产物是氨基酸。在蛋白质分子内又通过氢键、盐键、疏水作用力构成蛋白质的空间结构,即蛋白质的构象( conformation )。当蛋白质分子受到某些物理、化学因素影响时,它的空间结构就会发生改变或破坏,物理化学性质和生物学性质也随着发生变化,称为蛋白质的变性作用。因此在研究蛋白质的生物学功能时,应防止它的变性作用。

       蛋白质在溶液中的分子大小,溶解度,电荷,吸附性质和对其他分子的亲和力等各不相同,根据这些因素,可以选择一定的方法分离,制备和鉴定蛋白质。利用蛋白质肽链末端基的特点,还可以设计特殊的分析技术来测定蛋白质的一级结构。

       氨基酸是构成蛋白质的基本单位,它也是生物体维持生长所必需的营养物质,具有特殊的生理作用,参与生物机体的代谢。因此对氨基酸的分离测定在实际工作中也是重要的。

       蛋白质含量可从它们的物理化学性质,如折射率、比重,紫外吸收、染色等测定而得知;或用化学方法,如定氮、双缩脲反应、 folin﹣酚试剂反应、BCA法等方法来测定。其中 Folin ﹣酚试剂法和考马斯亮蓝染色法是一般实验室中经常使用的方法。而 Folin﹣酚试剂法灵敏度较高,较紫外吸收法灵敏10~20倍,而较双缩脲法灵敏100倍左右。这类方法操作简便、迅速,不需要复杂和昂贵的设备,又能适合一般实验室的要求,若作一般测定较为适宜。

       一、双缩脲法

          1.原理

         在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比,而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围1~10mg蛋白质。

         双缩脲法于需要快速但并不需要十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应,使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。

         干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂,例如 Tris 缓冲液,因为它们给予阳性呈色反应。Cu2+也容易被还原,有时发现出现红色沉淀。

         2.器材

        蛋白的提取(可根据预实验结果适当调整样本量及比例) ①组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:(5-10)的比例(建议称取 0.1 g 组织,加 入 1 mL 提取液)处理样品,冰浴匀浆,4℃ 10000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。 ②细菌或细胞:离心收集细菌或细胞到离心管内,按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL) 为(500-1000):1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1 mL 提取液)处理样品,冰浴超声破碎(功 率 300 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 3 min),4℃ 10000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。 ③液体样本:澄清无色液体样品可以直接或使用提取液适当稀释后再进行测定。

       测定过程中所需要的仪器和试剂:可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移 液器、台式离心机和蒸馏水。

       3.注意事项

         待测样本蛋白浓度须在 0.5-10 mg/mL 范围内,正式测定应取 1-2 个差异样本进行预实验,确保 蛋白浓度在此范围内,低于 0.5 mg/mL 则不能使用此法测定,高于 10 mg/mL 或吸光值大于 0.4 应使用 Extract Solution 适当稀释后再进行测定,计算时相应修改。

       二、Folin﹣酚试剂法(Lowry法)

       1.原理

       用于蛋白质测定的 Lowry 反应是双缩脲方法的发展,Lowry 蛋白含量检测法是通过蛋白质与铜离子在碱性条件下生成蛋白质-铜络合物,进一步将 Folin 试剂还原生成深蓝色化合物,产物在 650 nm 处具有特征吸收峰,通过吸收值的变化即可定量检 测样品蛋白浓度。

       这个测定法较双缩脲法灵敏得多。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素(约0.5%左右)、胍(0.5%左右)、硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙的酸(0.5%)、乙的醇(5%)、(5%)、丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,这些物质浓度高时必须做校正曲线。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

       2.器材

       分光光度计    恒温水浴

       3.检测方法优势

       ①移液器移取少量液体时的误差,会对标准曲线低浓度点造成影响,样品点应落在标准线 1/2 后;

       ②BSA Standard Solution 4℃保存有效期 3 个月,-20℃保存有效期一年,其他试剂室温保存有效 期一年,试剂开封使用后请及时密闭保存;

       ③Lowry 法定量范围为 50-500 µg/mL,Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 样品若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用,不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使 显色强度稍有不同;

       三、考马斯亮蓝染色法(Bradford法)

       1.原理

       1976年 Bradford 建立了用考马斯亮蓝 G -250与蛋白质结合的原理,迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变,从465nm变为595nm,光吸收增加。蛋白质﹣染料复合物具有高的消光系数,因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度,最大低检出量为1ug蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程,大约只需2分钟,结合物的颜色在1小时内是稳定的。一些阳离子,如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4,乙的醇等物质不干扰测定,而大量的去污剂如 TritonX -100, SDS 等严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。以下试剂对考马斯亮蓝 G -250-蛋白质复合物有影响:1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙的醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法简单迅速,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

       2.器材

       分光光度计     微量注射器

       检测方法优势

       Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响,样品中巯基乙的醇的浓度可 高达 1 M,二硫苏糖醇的浓度可高达 5 mM;但受略高浓度的去垢剂影响,需确保样品中 SDS 浓度低 于 0.1%,TritonX-100 低于 0.1%,Tween 20、60、80 低于 0.06%;

       四、BCA法

       1.产品描述

       BCA(Bicinchonininc Acid)蛋白含量检测法是用于总蛋白质定量的常用方法,BCA 与二价铜离 子混合即为 BCA 工作液,蛋白在碱性条件下能够将 Cu2+还原为 Cu+,Cu+与 BCA 试剂可形成紫色络 合物,产物在 562 nm 处具有特征吸收峰,通过吸光值变化即可定量检测样品的蛋白浓度。

       2.注意事项

       ①Copper Solution 与 PBS Diluent 可置于 2-8℃长期保存,若发现污染浑浊则应丢弃;BCA Solution 在低温条件下出现结晶沉淀时,可 37℃温育使其*溶解,不影响使用;

       ②为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

       检测方法优势

       ③BCA 法测定蛋白含量不受绝大部分样品中化学物质的影响,样品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用浓度去垢剂不影响检测结果,但 EDTA 和 EGTA 等螯合剂、DTT 和巯基 乙的醇等还原剂和脂类会影响检测结果,需确保 EDTA 低于 10 mM、无 EGTA、二硫苏糖醇低于 1 mM、 巯基乙的醇低于 0.01%;若样品含有较多干扰物质且本身背景值较高,建议使用 Bradford 法蛋白含量检测试剂盒(Cat AKPR015);

       ④若蛋白浓度较低时(小于 50 μg/mL),可将显色温度提高至 60℃且待测样本

与工作液比例调整 为 1:8 进行测定,能够明显提高灵敏度至 5 μg/mL;

       ⑤为保证结果准确且避免试剂损失,测定前请仔细阅读说明书(以实际收到说明书内容为准), 确认试剂储存和准备是否充分,操作步骤是否清楚,且务必取 2-3个预期差异较大的样本进行预测定,过程中问题请您及时与工作人员联系。


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