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核黄素(维生素B2)荧光光度定量测定法

发布时间: 2022-04-07  点击次数: 159次

 一、目的

       1.了解荧光法测定核黄素的原理和方法

       2.学习荧光光度计的操作和使用

       3.掌握荧光定量分析工作曲线

二、原理

       核黄素(维生素B2)是一种异咯嗪衍生物,其水及乙醇的中性溶液为黄色,并且有很强的荧光,这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物,同时失去荧光,因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化,恢复其荧光,

三、实验器材

       1.核黄素片(5mg/片)

       2.荧光光度计

       3.容量瓶100ml(*2)

       4.试管1.5cm*15cm(*7)

       5.吸管10.0ml(*1),5.0ml(*1),2.0ml(*1),0.50ml(*2)

       6.量筒1000ml(*1),100ml(*1)

四、实验试剂

       1.核黄素标准溶液:准确称取核黄素10mg,放入预先装有约50ml蒸馏水的1000ml容量瓶中,加入 5ml 6mol/ L 乙酸,再加入大约800ml水,置水浴中避光加热直至溶解,冷却至室温,用蒸馏水定容至1000ml,混匀。

       2.连二亚硫酸钠(保险粉)或亚硫酸钠。

       3.  36%乙酸。

五、操作

    1.标准曲线绘制

       将配好的10ug/ ml 标准核黄素溶液,按表50所示比例稀释成六个标准溶液。

    2.样品溶液的配制

       将被测的样品(如核黄素药片、维生素 B 针剂等)参照标准溶液的含量范围和溶剂体系配制成测定溶液。对于食物和生物材料中的核黄素测定,一定需要事先经过抽提,或经过分离,纯化处理。

    3.荧光测定

       参照附录六中荧光光度计的使用说明,选用滤色片,核黄素荧光测定的激发光波长为460nm,发射光波长为520nm。因此可选用带迪型400nm(蓝色)滤色片为激发光滤色片,选用截止型510nm(红色)滤色片为发射光滤色片。待仪器预热并调好零点后,用0号标准溶液(2.5ug/ ml )作为参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度(100%),分别测定其他标准溶液和样品溶液的相对荧光强度,在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100%则需要再行稀释,在每一个测定溶液测定完后,需要重新倒回到相应的试管内。

    4,  数据处理

       每一个测定溶液的荧光强度读数矫正公式为:F=F1+F2

       式中 F:校正后的荧光强度;

               F1:未还原时测得的荧光强度:

               F2:还原后测得的荧光强度。

       以标准溶液校正后的荧光强度为纵坐标,相应的含量为横坐标,作出核黄素测定的标准曲线。将样品溶液校正后的荧光强度在工作曲线上查出相应的含量。

六、注意事项

       在所有操作过程中,要避免核黄素受阳光直接照射。


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