四种蛋白含量测定方法（双缩脲法、BCA法、Lowry法，考马斯亮蓝法）

 蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要和最必需的组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织干物质的主要部分。例如，人体按总量计算，干重54％是蛋白质，即除去水分后，蛋白质约占体重的一半左右，可见蛋白质是生命活动中最重要的物质基础。

       蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子化合物，它水解的最终产物是氨基酸。在蛋白质分子内又通过氢键、盐键、疏水作用力构成蛋白质的空间结构，即蛋白质的构象（ conformation )。当蛋白质分子受到某些物理、化学因素影响时，它的空间结构就会发生改变或破坏，物理化学性质和生物学性质也随着发生变化，称为蛋白质的变性作用。因此在研究蛋白质的生物学功能时，应防止它的变性作用。

       蛋白质在溶液中的分子大小，溶解度，电荷，吸附性质和对其他分子的亲和力等各不相同，根据这些因素，可以选择一定的方法分离，制备和鉴定蛋白质。利用蛋白质肽链末端基的特点，还可以设计特殊的分析技术来测定蛋白质的一级结构。

       氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它也是生物体维持生长所必需的营养物质，具有特殊的生理作用，参与生物机体的代谢。因此对氨基酸的分离测定在实际工作中也是重要的。

       蛋白质含量可从它们的物理化学性质，如折射率、比重，紫外吸收、染色等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 folin﹣酚试剂反应、BCA法等方法来测定。其中 Folin ﹣酚试剂法和考马斯亮蓝染色法是一般实验室中经常使用的方法。而 Folin﹣酚试剂法灵敏度较高，较紫外吸收法灵敏10~20倍，而较双缩脲法灵敏100倍左右。这类方法操作简便、迅速，不需要复杂和昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般测定较为适宜。

       一、双缩脲法

       1.原理

        在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围1~10mg蛋白质。

        双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。硫酸铵不干扰此呈色反应，使其有利于对蛋白质纯化早期步骤的测定。

        干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，例如 Tris 缓冲液，因为它们给予阳性呈色反应。Cu2+也容易被还原，有时发现出现红色沉淀。

       2.试剂和器材

         ①试剂

    标准酪蛋白溶液（10mg/mL)：酪蛋自要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量配制成标准溶液。用0.05mol/L 氢氧化钠溶液配制。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

       双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O )，用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需重新配制。

       ②器材

         分光光度计，恒温水浴

       3．操作方法

        标准曲线的制定：取12只试管分成两组，分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的标准酪蛋白溶液，用水补足到1mL，然后各加入4mL双缩脲试剂，充分摇匀后，在室温下（20~25℃）放置30分钟，于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值，以酪蛋白的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线，作为定量的依据。

        用同样的方法测定未知样品，注意样品浓度每ml不要超过10mg，否则要适当稀释。

       二、Folin﹣酚试剂法（Lowry法）

         1.原理

         用于蛋白质测定的 Lowry 反应是双缩脲方法的发展，第一步涉及到在碱性溶液中铜﹣蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸﹣磷钨酸试剂（Folin氏试剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。这个测定法较双缩脲法灵敏得多。对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸钠（1%)、硝酸钠(1%)、三氯乙SUAN（0.5%)、乙醇（5%)、乙MI（5%)、丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠﹣氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸钠﹣氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

         进行测定时，加 Folin 氏试剂要特别小心，因为 Folin 氏试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但上述还原反应只是在pH10的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜﹣蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸﹣磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨SUAN和色氨SUAN的定量测定。

       2.操作方法

    2.1样品测定

           取1ml样品溶液（约含20-250ug多肽或蛋白质），加入5ml试剂甲，混匀，于20~25℃保温30分钟，然后于500nm处比色。以1ml水样替代品作为空白对照。

       2.2标准曲线的制定

           取14只试管分成两组，分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL标准蛋白溶液（250ug/ml），用水补足到1mL，然后按上述方法进行操作，测定光吸收值。取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。

          若用0.5cm光程的比色池进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2ml样品溶液（约含5~100ug多肽或蛋白质），加入1ml试剂甲（可选用0.3cm~0.5cm直径的小试管），混匀，10分钟后再加0.1ml试剂乙，立即摇匀，30分钟后比色。若多肽或蛋白质浓度在5~25ug，则波长用755nm，25ug以上则采用500nm比色为宜。

       3.试剂和器材

          3.1试剂

1. 标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成250ug/ml的溶液。

2. Folin-酚试剂的配制（均用分析纯试剂）：

    试剂甲：由下述4种溶液配制的。（1）4％碳酸钠（ Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L 氢氧化钠溶液；（3）1％硫酸铜（ CuSO4•5H2O ）溶液；（4）2％酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配成碳酸钠﹣氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜﹣酒石酸钾钠溶液。然后将这两种溶液按50:1的比例混合，即为 Folin﹣酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。

          试剂乙（ Folin 氏试剂）：市售福林酚试剂

       3.2器材

          分光光度计    恒温水浴

       三、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）

         1.原理

          1976年 Bradford 建立了用考马斯亮蓝 G -250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质﹣染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，检出量为1ug蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。一些阳离子，如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如 TritonX -100, SDS 等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。以下试剂对考马斯亮蓝 G -250-蛋白质复合物有影响：1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法简单迅速，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

       2.操作方法

    2.1标准方法

     取含10~100ug蛋白质溶液于小试管中，用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL ，然后加入5mL蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595nm测定光吸收值。以0.1mL 双蒸水或缓冲液及5mL 蛋白试剂作为空白对照。

       2.2微量蛋白分析法

     取含1~10ug蛋白质溶液，用双蒸水调体积到0.8mL，加0.2mL蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595nm测定光吸收值，以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。

     用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，以蛋白浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量的依据。

       3.试剂和器材

    试剂

1. 标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/ mL 的溶液。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数 A1% 1cm＝6.6来确定。

2. 蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%（W/V）磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。试剂的终浓度为0101%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

   器材

         分光光度计     微量注射器

       四、BCA法

          1.产品描述

             BCA（Bicinchonininc Acid）蛋白含量检测法是用于总蛋白质定量的常用方法，BCA 与二价铜离 子混合即为 BCA 工作液，蛋白在碱性条件下能够将 Cu2+还原为 Cu+，Cu+与 BCA 试剂可形成紫色络 合物，产物在 562 nm 处具有特征吸收峰，通过吸光值变化即可定量检测样品的蛋白浓度。

          2.注意事项

            ①Copper Solution 与 PBS Diluent 可置于 2-8℃长期保存，若发现污染浑浊则应丢弃；BCA Solution 在低温条件下出现结晶沉淀时，可 37℃温育使其*溶解，不影响使用；

            ②为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；

            ③BCA 法测定蛋白含量不受绝大部分样品中化学物质的影响，样品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用浓度去垢剂不影响检测结果，但 EDTA 和 EGTA 等螯合剂、DTT 和巯基 乙醇等还原剂和脂类会影响检测结果，需确保 EDTA 低于 10 mM、无 EGTA、二硫苏糖醇低于 1 mM、 巯基乙醇低于 0.01%；若样品含有较多干扰物质且本身背景值较高，建议使用 Bradford 法蛋白含量检测试剂盒（Cat AKPR015）；

            ④若蛋白浓度较低时（小于 50 μg/mL），可将显色温度提高至 60℃且待测样本

与工作液比例调整 为 1:8 进行测定，能够明显提高灵敏度至 5 μg/mL；

            ⑤为保证结果准确且避免试剂损失，测定前请仔细阅读说明书（以实际收到说明书内容为准）， 确认试剂储存和准备是否充分，操作步骤是否清楚，且务必取 2-3个预期差异较大的样本进行预测定，过程中问题请您及时与工作人员联系。